eCLIP-seq

      相比RIP-seq，为了提高RBP（RNA结合蛋白）结合序列的分辨率，开发的技术中以CLIP-seq及其衍生技术最为通用。eCLIP-seq（Enhanced UV crosslinking and immunoprecipitation）依据iCLIP-seq基本实验原理改进而来：首先紫外交联形成蛋白-RNA复合物，片段化RNA后进行IP实验，相比CLIP-seq，不需要³²P的放射性标记，使用PAGE胶切胶回收蛋白-RNA复合物，经过蛋白酶K消解后会有部分氨基酸残基残留在RNA上并使逆转录过程终止和错配形成最终测序reads在基因组上堆积，实现以高精度鉴定RBP在全转录组范围内的结合位点。

eCLIP-seq送样要求

eCLIP-seq原理

结果展示

文章案例

ILF3抑制重复序列产生的miRNA从而影响RIG-I介导的I型干扰素反应

      1.敲低ILF3和WT样本miRNA-seq发现上调表达miRNA数量更多（图A），通过miRNA sensor reporter系统验证ILF3可以抑制miRNA成熟过程；

      2.提核CLIP-seq发现ILF3（NF90和NF110，ILF3两种蛋白异构体）可以直接结合pri-miRNA（图B），其中多数peak来源于重复序列元件（占比最高Alu）并抑制miRNA加工过程；

      3.DROSHA和DGCR8的RIP-qPCR（图C）确定ILF3可以与DROSHA和DGCR8竞争性结合pri-miRNA靶标从而抑制其加工过程；

      4.RNA-seq发现ILF3敲低RIG-I表达水平降低（图D），通过分析RIG-1的mRNA 3’UTR序列发现有ILF3结合的miR-582-3p结合位点（图E）；

      5.RIG-1激活剂和miR-582-3p抑制剂验证表型，证明ILF3可以抑制miR-582-3p成熟过程促进RIG-1表达，从而促进I型干扰素反应。

参考文献：Geng Chen, Yang Yang, Qi-Jia Wu, Xiang-Dong Fu, Yu Zhou, et al. ILF3 represses repeat-derived microRNAs targeting RIG-I mediated type I interferon response, Journal of Molecular Biology, Volume 434, Issue 7, 2022, 167469,DOI: 10.1016/j.jmb.2022.167469.