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T细胞受体(T cell receptor,TCR)是T细胞表面,负责特异性识别与MHC(主要组织相容性复合体)结合的抗原肽的蛋白。当TCR与抗原肽和MHC结合时,T淋巴细胞通过信号转导被激活,进入后续的免疫应答过程。 人类基因组中有4个TCR基因:
- 两个编码轻链TCR:TRA基因编码TCRα,TRG基因编码TCRγ;
- 两个编码重链TCR:TRB基因编码TCRβ,TRD基因编码TCRδ;
重链TCR和轻链TCR形成异源二聚体,组成完整的TCR。在人类中存在两种TCR:TCRα/β和TCRγ/δ,其中95%的T细胞表达TCRα/β,称为αβT细胞;5%的T细胞表TCRγ/δ,称为γ/δT细胞。该比例在个体发育过程中和患病状态(例如白血病)中发生变化,物种之间也有所不同。
成熟的重链TCR基因由可变区(V)、多变区(D)、连接区(J)和恒定区(C)四部分基因片段组成(VDJC),轻链TCR则缺少D区(VJC)。重链和轻链TCR都具有3个互补决定区(complementarities determining region, CDR),在抗原识别中起主要作用:
- CDR1和CDR2相对保守,负责识别MHC;
- CDR3是负责识别抗原的主要CDR;
TCR基因是人类基因组中复杂度最高的基因,也是变异程度最高的基因。人外周血中大概含有2x1016~1018种表达不同的TCR的T细胞。这个复杂度主要源自3个因素:
- 组成的多样性:成熟TCR的VDJC/VJC结构,是通过复杂的重组生成的。基因组中有65~100种V基因片段、2种D基因片段和13种J基因片段,TCR重组时需要从上述三种片段中各选一个,这赋予了TCR高度的多样性;
- 连接的机动性:在重排的过程中,在V-D及D-J的连接区经常有非模板的核苷酸的随机插入或删除,进一步增加了CDR3区的多样性;
- 体细胞突变:T细胞D区的突变频率约为正常的1000倍;
TCR-seq常用于评价各种免疫相关疾病和遗传性突变引起的某个物种所有T细胞或特定T细胞激活介导的细胞免疫反应中TCR基因重排碱基序列,以及各序列的丰度,用于研究不同T细胞克隆的转录情况和相互间关系,从而揭示更深层次的T细胞功能特异性,继而解释免疫应答机制、免疫耐受原因,免疫调节形式等相关生命现象。
TCR-seq是为检测TCR多样性发展出来的测序技术,目前有两大主流技术:多重PCR和5' RACE。两种技术的原理如下图所示,技术优劣势如下表所示:
上述两种技术都有两个共同的问题:PCR重复引入的定量准确性问题和PCR/测序扩增引入的假阳性TCR问题。
- 不同TCR之间扩增效率无法一致,因此不同TCR扩增时会不同程度的引入重复TCR分子,给定量带来问题;
- TCR复杂度高,不同TCR之间可能只有少数碱基差异;PCR/测序过程中引入碱基错误,在没有纠错机制的情况下,会被当成新的TCR处理,造成假阳性;
为解决上述TCR-seq中的技术问题,康测开发出“绝对定量TCR-seq”测序技术,其原理为在扩增偏好性更低的5' RACE技术基础上,引入我公司UMI/UID数字标签纠错技术,其原理如下图所示:
- 多物种:我们可针对不同物种,开发TCR-seq检测技术;
- 完整TCR检测:该技术使用5’RACE技术原理,可以获得TCR的完整序列,全面研究CDR1/2对MHC的亲和力影响;
- PCR偏好性低:该技术使用5’RACE技术原理,相较于mPCR具有更低的偏好性;
- 定量准确:通过引入UMI数字标签,进一步去除PCR扩增重复和测序重复、彻底排除重复引入的定量问题,准确还原TCR克隆的丰度;
- 无假阳性:通过引入UMI数字标签,多序列比对校正PCR和测序错误,去除假阳性TCR;
您只需要:
- 确定检测的TCR链;
- 提供足量的T细胞、组织或全血;
- 我们将完成RNA提取、建库、测序和分析的全部工作;
UMI/UID去重后,TCR reads由900万降低到200万,去除了600万由于PCR过度扩增引入的重复Reads;
UMI/UID纠错后,TCR 种类由99万降低到63万,去除了1/3的假阳性克隆
UMI/UID去重、纠错前后,TCR复杂度、种类、含量的变化
UMI/UID去重、纠错前后,对两个重复样本的检测,罕见克隆鉴定灵敏度从千分之一提高到万分之一
经测试,我们的TCR-seq检测到的TCR含量可以在10-1 ~ 10-4范围内保持线性
TCR-seq
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