技术简介

 

真核生物mRNA的成熟需要经历三个主要的加工过程：剪接、5'加帽、3‘加尾；而5‘加帽则是其中第一个加工步骤：在RNA被转录出25-30个碱基就会开始加帽修饰。因此，成熟mRNA的5’末端都带有m7G帽子结构。

 

 

mRNA的5‘ cap具有重要的生物学功能：它一方面可以保护RNA免于5’-3‘核酸外切酶降解，另一方面作为一个锚点为剪接、加尾以及出核募集相关蛋白。而5‘ cap最重要的生物学功能，则是其在翻译起始过程中的作用。

 

 

eIF4F复合物（包括eIF4A、eIF4E和eIF4G）识别mRNA的帽结构，并通过PABP的作用介导mRNA形成首尾相邻的环状结构，进而招募43S预起始核糖体复合物扫描AUG起始密码子，从而介导翻译的起始。同时，不同的5’ cap位点的使用，意味着基因使用了不同的转录起始位点（TSS）、不同的启动子，以及不同的转录因子的调控。因此对5‘ cap的研究具有重要的生物学价值。

 

CAGE-seq的应用

  1. 新基因的鉴定；

  2. 基因结构优化；

  3. 转录起始位点鉴定；

  4. 可变启动子鉴定；

  5. 功能转录因子的鉴定；

  6. 双向增强子RNA的鉴定；

  7. 灵敏准确的基因表达定量分析。

  8.  

CAGE-seq方法综述

 

CAGE-seq（Cap Analysis of Gene Expression by deep sequencing）是发展出来专门研究mRNA加帽位点的测序技术。其技术原理，是通过高通量测序的方法，对通过不同手段富集到的mRNA 5'序列进行测序，从而获得mRNA的不同起始位点，以及不同起始位点的使用情况。目前已经发展出了至少3大类5’ mRNA的富集方法，如下图所示：

 

 

  1. 亲和纯化：此类方法的核心是对mRNA的5‘ cap结构进行生物素标记，进而对mRNA进行片段化，然后通过亲和纯化的方式富集RNA的Cap段进行建库测序，代表方法为经典的CAGE-seq和RAMPAGE-seq；

  2. 直接连接：此类方法首先对RNA进行去磷酸化处理，将不带cap结构的RNA5‘处理成羟基，然后使用TAP（烟草酸性焦磷酸酶）处理，将CAP结构变成单PO4，然后在RNA的5‘直接进行连接接头，只有由CAP生成5’-PO4的RNA可以发生连接，从而确定RNA的cap；

  3. 链置换：此类方法的核心是利用逆转录酶的末端转移酶活性（TDT，Terminal deoxynucleotidyl transferase）和链置换（template switching）活性，在逆转录体系中加入特定引物，在逆转录至mRNA的cap后，逆转录酶的TDT活性和链置换活性会转换模板使用引物为模板继续逆转录，从而生成测序文库，代表方法为STRT-seq和NanoCAGE-seq；

 

上述三种方法各有优缺点：前两种方法对RNA的需求量大，操作步骤繁琐，成本也高，但准确性高；后面一种方式效率很高，RNA需求量少，但TDT和链置换的特异性较低，因此假阳性较高；

 

康测产品及其优势

 

1、nanoCAGE的问题在于没有cap的RNA逆转录之后仍有一定比例会发生TDT，进而链置换生成文库，从测序数据中是无法区分来自CAP的序列和其他来源的序列的，因此会产生一定的假阳性；

2、为了解决这个问题，我们对NanoCage的方法进行了改进，其原理如下图：

  1. 1）主动对非Cap结构的RNA进行了消解和去除，降低假阳性来源；
  2. 2）使用连接而非Template switch进行测序接头的添加：只有严谨的GGG:CCC配对连接才能发生，降低了非cap来源TDT-cDNA的使用率，降低假阳性；
  3. 3）建库过程中加入UMI分子标签，去除PCR重复以获取更为准确的定量结果（原理点击这里）。

 

服务流程

 

 

结果示例

 

UID CAGE-seq