DNA甲基化

DNA甲基化和去甲基化

DNA甲基化是将一个甲基基团添加到DNA分子的过程。DNA的四个碱基中的两个，胞嘧啶和腺嘌呤，可以被甲基化，最普遍也是研究最深入的胞嘧啶第5位的甲基化，5mC。

5mC在真核生物和原核生物中均很普遍，但甲基化程度在物种之间差异很大：拟南芥中约14％的胞嘧啶甲基化，小鼠中约7.6％，绒泡菌中4％至8％，大肠杆菌2.3％，在果蝇0.03％，果盘杆菌中为0.006％，而在秀丽隐杆线虫真菌中则几乎不发生甲基化。

5mC甲基化是依赖胞嘧啶的所在的环境序列的，主要有三种序列环境：CG（或CpG），CHG或CHH。在哺乳动物中，虽然非CpG甲基化在胚胎干细胞、造血祖细胞中被报道过，DNA甲基化几乎只存在于CpG二核苷酸中；但是在植物中，尤其是植物特异的rdDM（RNA介导的DNA甲基化）过程中，胞嘧啶的甲基化则不依赖该序列环境，CG、CHG和CHH都可能维持很高水平。

DNA的甲基化和去甲基化处在一个动态平衡中，都是由酶来催化的：

DNA甲基化是由DNMT（DNA甲基化转移酶）家族成员催化和维持的，其中DNMT3负责催化新的甲基化产生，而DNMT1则维持已有胞嘧啶的甲基化；
DNA去甲基化则是一个复杂的过程，TET家族蛋白首先氧化5mC产生5hmC，进而是5fC和5caC，最终被TDG糖苷酶识别并切割，形成无碱基AP位点，并通过碱基切除修复（BER）生成未甲基化的胞嘧啶；

DNA甲基化介导的基因表达调控

DNA甲基化和去甲基化的动态平衡控制着生物体中基因表达的强度。甲基化可以改变DNA片段的活性，当位于基因启动子中时，DNA甲基化通常起到抑制基因转录的作用。在哺乳动物中，DNA甲基化对于正常发育至关重要，并且与许多关键过程相关，包括基因组印迹，X染色体失活，转座因子阻抑等，DNA甲基化水平的异常会导致疾病发生。

DNA甲基化可以直接或间接调控基因的表达：

直接的，DNA甲基化可以直接阻止转录因子对启动子的识别，从而调控基因的转录；
间接的，DNA甲基化可以招募MBD蛋白（methyl-CpG-binding domain protein)，封闭转录因子的结合位点，从而调控基因的转录；
间接的，DNA甲基化可以通过MBD蛋白介导与组蛋白修饰互作，产生抑制性的染色质结构，通过改变染色质结构来调节基因表达。

BS-seq

亚硫酸盐转换（Bisulfite conversion）

DNA中的胞嘧啶，在使用亚硫酸盐处理时，会发生脱氨基反应，最终从胞嘧啶（C）转换成尿嘧啶（U）；如果胞嘧啶发生了5mC甲基化修饰，这个转换则无法发生，处理之后仍然是胞嘧啶。通过上述原理，对基因组DNA进行亚硫酸盐转换，建库和高通量测序，通过对测序Reads中C-T转换进行分析，即可在单碱基分辨率上检测全基因组甲基化修饰的状态。

BS-seq建库

传统的BS-seq文库构建过程如下图左所示：首先将DNA进行片段化、末端修复，连接甲基化修饰的接头（该修饰可以保证接头在BS处理时不发生C-T碱基转换，以维持下游PCR的引物配对）；进而进行BS转换，将转换之后的DNA进行PCR扩增，即可以得到C-T转换之后的文库。这种方式存在很大的缺陷：亚硫酸盐转化的同时会伴随的DNA降解，降解发生在去嘌呤化的过程中，导致DNA的随机断裂。充分的转化可能导致约90％的DNA降解。因此该方法需要较大的DNA起始量，同时文库会存在很强的偏好性。

为了解决这个问题，先后出现了多种“转化后建库”的测序方法，如：