Ribo-seq·核糖体印记测序

     Ribo-seq（Ribosome profiling，也称翻译组），是指对与核糖体结合的正在翻译的RNA片段进行测序，来准确获取样本中所有可翻译分子（包括mRNA和其他潜在可翻译RNA分子如lncRNA、circRNA等）的信息与精确定量，是连接转录组与蛋白质组之间的桥梁。

  由于核糖体对与之结合的~30nt mRNA序列具有保护作用，利用RNA酶消化细胞中的RNA后，这些被核糖体保护的RNA片段可以被富集，经过一系列提取、分离、纯化、建库、深度测序、分析，能获得全面的、高质量的蛋白质翻译速度情况，了解蛋白质表达水平及其丰度，还能直接对翻译过程进行研究。结合转录组、小RNA测序、蛋白组等进行关联分析，可以更精确地研究转录后调控、翻译调控机制。

项目流程

Ribo-seq项目整体流程

技术优势

      分子标签加持：UMI（Unique Molecular Identifier）减少PCR扩增误差，提高定量准确性，减少测序错误影响。
      直接测量翻译活性：直接测量细胞中正在进行翻译的mRNA片段，提供蛋白质合成的直接证据。
      动态监测：捕捉到翻译过程中的动态变化，反映细胞在不同条件下的翻译活性。
      高分辨率：提供接近单个核苷酸的分辨率，以确定翻译的起始位点和翻译效率。
      与其他组学数据整合：可以与转录组、蛋白质组和代谢组数据相结合，提供更全面的生物学信息。

Ribo-seq应用场景

一、翻译机制的探索

1. 关注正在翻译的基因中，哪些处于高效翻译，调控参与翻译效率的原件有哪些；

2. 解释双解码的发生机制，哪些基因可以发生双解码，具有哪些结构特征；

3. 探究非常规的现象。

二、深化转录组分析

1. 关注差异表达的基因中，究竟有哪些正在翻译，且翻译效率如何；

2. 缩小差异基因的范围，只关注正在翻译的基因；

3. 若差异表达基因太少，可通过Ribo-seq发现更多差异基因。

三、可用于解释转录组和蛋白组结果不一致

1. 当基因转录不翻译，或者翻译效率低时，可能会出现转录组显示有差异或者差异显著，而蛋白组无差异或差异不显著；

2. 若只检测了蛋白组，仅能粗略定位到基因区域，但无法明确转录本，更无法明确转录本中的编码ORF。

四、深化非编码RNA的测序分析

1. 当用于探究LncRNA中的TUCP是否具有编码功能；

2. 研究circRNA对应的线性RNA是否具有翻译功能，开环后是否在进行翻译。

案例解析

标题：The Translational Landscape of the Human Heart

  人体组织中的基因表达主要在转录水平上进行研究，翻译调控却往往被忽略。作者分析了80个心脏的翻译组，以识别新的翻译事件并量化翻译调节的影响。

  为了研究心脏mRNA的表达和翻译，作者对65名终末期扩张型心肌病患者和15名健康对照组的人左心室心脏组织进行了转录组和翻译组测序（下图A）。Ribo-seq数据显示了活跃翻译中核糖体的3-nt密码子移动特征（下图B）。为了对人类心脏中的翻译序列进行分类，作者进行了de novo转录组组装（下图C）。在22335个鉴定到的ORF中，有1090个upstream ORF（下图D）和339个short ORF，分布于169个预测的lncRNA的非重复序列中（下图E）。

      PCA分析揭示了细胞外基质生成的特异性翻译上调（下图B和C）。在919个基因（占所有翻译基因的8%）中共检测到1090个活跃翻译的uORFs，这些基因显示出翻译效率的降低（下图D）。

参考文献：

van Heesch S, Witte F, Schneider-Lunitz V, et al. The Translational Landscape of the Human Heart. Cell. 2019;178(1):242-260.e29.