lncRNA测序

 

研究对象

LncRNA-seq是专门检测lncRNA的测序手段吗？

 

不是的，lncRNA-seq还可以检测全部mRNA和部分circular RNA的表达，但其主要目的是为了检测lncRNA。

 

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lncRNA和来源

 

        LncRNA（Long non-coding RNA，长链非编码RNA )是指长度大于 200 个核苷酸、同时不具备蛋白编码能力的一大类RNA的总称。lncRNA是一个庞大的家族，截止2018年各类RNA数据库、文献报道的人类lncRNA数目已经达到270,044个。数目如此巨大的lncRNA分类是一个大问题，由于lncRNA序列、结构的多样性，目前常用的分类方式，是根据lncRNA的来源分类，主要包括以下几类：

• lincRNA：基因间区转录出的lncRNA；
• Intronic lncRNA：基因的内含子区转录出的lncRNA；
• Exonic lncRNA：外显子区转录出的lncRNA；
• NATs：基因区转录出的反义RNA；
• eRNA：增强子区转录出的RNA；
• Promoter lncRNA：启动子区转录出的RNA
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lncRNA的功能

 

        虽然数目众多，但lncRNA基因的表达水平远低于蛋白编码基因，同时其表达又具有显著的特征：大多数lncRNA（〜78％）的表达具有组织特异性（mRNA仅为〜19％）、更高的发育阶段特异性，甚至是细胞亚型特异性。这暗示其重要的调控功能。目前的研究发现，lncRNA在表观、转录、翻译甚至翻译后修饰等各个层面都可以调控基因的表达，如下图：

• 表观遗传学调控： 部分lncRNA可募集染色质修饰蛋白到特定基因组基因座上发挥功能，改变DNA/RNA甲基化状态，染色体结构和修饰状态，进而控制相关基因的表达；
• 转录体调控：一些lncRNA可作为配体与转录因子结合为复合体，控制基因转录活性；
• 转录后调控：lncRNA还可直接参与可变剪切，RNA编辑，蛋白翻译与转运等过程中，发挥调控作用；
• 调控miRNA：lncRNA通过ceRNA机制与miRNA相互作用，调控靶基因的表达调控。
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lncRNA的研究思路

 

 

 

        lncRNA的种类、数目太多，调控机制也异常庞杂，因此研究思路也高度多样，需要根据lncRNA的调控机制进行相应的设计，但lncRNA研究的前提，就是功能lncRNA的鉴定：发育过程、癌变前后、特定处理前后，都可能涉及lncRNA表达改变，因此lncRNA-seq就是解决此类问题的最佳工具：

 

 

 

 

LncRNA-seq

 

        LncRNA-seq是为lncRNA的鉴定、表达检测发展出来的测序方法。其技术原理，是对RNA中含量最高的rRNA进行剔除，进而通过磁珠筛选去除含量较高的小型RNA如tRNA、snRNA等，然后对剩下的所有RNA进行建库测序。上述处理之后的RNA中，除了lncRNA外，还包含全部的pre-mRNA、mRNA和部分circular RNA。

 

        因此，lncRNA-seq还可以检测全部mRNA和部分circular RNA的表达。其技术原理如下：

 

 

难点痛点

 

        LncRNA-seq虽然是目前最全面的RNA测序技术，但是其应用却存在很大的限制---只有少数物种可以进行lncRNA-seq。
问题的核心在于rRNA剔除的步骤。目前的rRNA剔除存在两种主要的技术手段：

• rRNA的RNase H消化去除；
• rRNA亲和捕获去除；

        这两种技术，都需要根据目标物种rRNA序列，设计特异性的antisense oligo。虽然rRNA基因是最保守的基因，但物种间仍存在差异，尤其是远源物种的序列差异很大，因此需要针对性的一一设计。这极大限制了LncRNA-seq的应用范围：目前商业化的rRNA剔除试剂盒，仅覆盖十余个动物、植物物种，以及数十种微生物。因此，大部分物种是无法进行LncRNA-seq的，尤其是细菌，由于其RNA缺乏polyA尾，连普通的mRNA-seq都无法完成，这极大限制了RNA-seq的应用。

 

        为此，我们对文献报道的DSN消化技术进行商业化，开发出无物种依赖的rRNA剔除产品。

 

        其技术原理，是通过对双链cDNA的变性和重新退火，再使用DSN酶消化双链DNA。该技术利用了DNA退火的动力学性质：浓度越高的 cDNA（rRNA来源）越快重新退火形成双链cDNA；而mRNA、lncRNA来源的cDNA含量很低，无法退火成双链。因此经过DSN处理之后，mRNA、lncRNA的cDNA得以保留，而rRNA的cDNA被消化掉。

 

 

该技术使得非模式动、植物物种，真菌，尤其是细菌的RNA研究成为可能。DSN rRNA剔除产品效果见下方“实测结果”部分。

 

 

技术优势

 

• 全面的检测产品：动物、植物、微生物全覆盖；模式生物、非模式生物一网打尽！
• 采用KC-digital RNA-seq建库技术，UMI数字标签让结果更准确！【点击】
• 全自动RNA提取、建库工作站，消除操作差异和批次效应，结果更稳定【点击】
• 强大的生信分析团队，提供全面的分析结果！
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服务流程

 

        您只需要提供足量的细胞/组织或RNA，我们将根据RNA来源的不同，选择合适的rRNA剔除方案并构建文库！！

 

 

实测结果

 

DSN rRNA剔除效果

这里展示的是罗非鱼和白色念珠菌两个物种，DSN剔除rRNA后进行RNA-seq的结果。

在2个物种中，rRNA残留的比例都在10%以下；且mRNA reads在基因上的分布很均一。

 

 

lincRNA-seq分析结果展示