绝对定量转录组测序（UMI RNA-seq）

RNA&测序

• 生物体细胞内存在着多种RNA，以真核生物为例，除了编码蛋白质的mRNA之外，还存在大量非编码的RNA。根据其功能又可以分为house keeping ncRNA（rRNA和tRNA）和Regulatory ncRNA。Regulatory RNA近年来被发现行使多种复杂的调控功能，是当前以及未来生物学研究的重点。

• 根据这些RNA的结构及长度，又可以分为长链非编码RNA（lncRNA）、小RNA（siRNA、miRNA、piRNA、snoRNA和snRNA）以及环状RNA（circRNA）。 

这些RNA各自具有不同的生物学功能，为了研究这些RNA的功能，目前发展出了多种测序技术对其表达进行检测。

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技术痛点

测序结果的准确性受到文库扩增时PCR偏好性的极大影响：

• RNA相关测序技术在文库的构建过程中都需要使用PCR扩增，从而产生重复的分子片段；
• 在测序过程的PCR扩增中，也会产生重复的分子片段。
• 但是所有的文库片段并非以同等速率等量的扩增，扩增速率受到片段长度、GC含量、片段浓度等多方面的影响，容易扩增的片段极大的被富集，一些含量较低的片段或碱基偏好严重的片段甚至完全丢失，最终影响测序结果的准确性。
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解决方案

KC-digital RNA-seq绝对定量UMI测序技术

为了解决现有RNA相关测序技术的技术难点，获得更准确的表达数据，康测科技开发出“绝对定量测序”技术，

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该技术在文库扩增之前为每一条逆转录的cDNA片段加上唯一的身份标签（Unique Identifier，UMI），也称为数字标签，数字标签会伴随片段扩增、测序、分析的全过程。

    绝对定量测序建库完成之后，同一个片段经过PCR扩增出来的产物均带有相同的数字标签，测序完成后利用UMI追溯每一个片段的来源，将相同来源的片段（具有相同的序列和UMI）进行合并，就能准确去除PCR扩增重复，一比一准确还原样本扩增前的原始状态。在此过程中，PCR扩增和测序错误同样可以被纠正：扩增和测序的错误会使得相同UMI标签对应多个不同的序列，那么只需比较这些序列的相似性，即可纠正这些错误。 

康测科技RNA相关测序产品，全线采用了KC-digital RNA-seq绝对定量UMI测序技术

技术优势

实测数据

UMI可以消除PCR扩增偏好引入的结果差异

左图：使用普通RNA建库试剂盒对同一个样品在不同扩增条件下获得的基因表达的一致性；

右图：使用KC-digitalRNA建库试剂盒对同一个样品在不同扩增条件下获得的基因表达的一致性。

KC-digital RNA-seq带来更高的qPCR验证结果

选择48个差异表达基因进行qPCR验证，分析qPCR和测序结果的相关性

左图：普通RNA-seq与qPCR实验结果的比较；右图：KC-Digital RNA-seq与qPCR实验结果的比较；

KC-DigitalRNA-seq测序结果与qPCR结果更为相符，有更高的一致性。