参与调控棉花纤维伸长的油菜素内脂转录调控网

 

引言

 

油菜素内脂(BRs)在植物的生长和发育过程中起着重要的调节作用，细胞伸长、光形态建成、衰老共生、脉管分化以及胁迫响应等过程均受到BRs调控。此外，BRs还与生长素、茉莉酸、细胞分裂素、乙烯、脱落酸、赤霉素、水杨酸等多种激素途径相互作用，共同构成复杂的植物发育和生理的激素调控网络。

以往研究表明，BRs通过BR信号传导通路调控下游靶基因的表达，从而影响植物的各种生理生化功能。而BES1/BZR1被鉴定为BR信号传导通路的核心转录因子，其中，BES1为转录激活因子。但在陆地棉（G. hirsutum）中BES1如何调控下游靶基因影响纤维伸长的作用机制尚不清楚。众所周知，ChIP-seq和DAP-seq是研究基因组上转录因子结合位点（transcription factor binding sites, TFBS）的有效方法，被广泛应用于转录因子靶基因的鉴定。但由于抗体质量、部分植物中转录因子表达量低、存在时空特异性等因素影响，ChIP-seq在植物上的应用受到限制。虽然，也有通过添加标签，用标签抗体进行植物ChIP-seq的情况，但部分植物转录因子也会考虑用DAP-seq进行TFBS研究，上述两种技术康测都有丰富的项目经验和严格的质控流程！此外，GWAS可以在全基因组范围内寻找SNP与性状相关的位点，并通过SNP位点定位与性状相关的基因。本研究中，作者联合DAP-seq、RNA-seq和GWAS的数据，筛选出与陆地棉纤维伸长相关的GhBES1.4靶基因，并构建了GhBES1.4调控纤维发育的转录调控网络。

 

 研究结果

1. 利用DAP-seq在GhBES1.4结合全基因组鉴定区域

首先，作者利用DAP-seq鉴定得到9894个可能的GhBES1.4结合区域(Figure 1A)，并统计了这些结合区域在基因组上的分布情况，发现在promoter区占比为17.17%(Figure 1B)。接着，作者统计了转录起始位点（TSS）上下游2.5 kb的peak数量。结果显示：GhBES1.4倾向于与TSS附近的DNA序列结合，且在启动子区500 bp内高度富集(Figure 1, C and D)。作者推测：GhBES1.4倾向于与启动子区DNA元件结合以调节基因表达。众所周知，转录因子主要与下游靶基因的启动子区结合从而发挥功能。因此，作者将筛选得到的1,531个分布在启动子区的GhBES1.4结合区域的关联基因作为GhBES1.4的靶基因。GhCPD、GhCYP90D1和GhBRL其中，被鉴定为靶基因。

2. 陆地棉中GhBES1.4结合位点的鉴定

以往研究表明BES1，可以靶向BRRE和E-box来调控基因的表达。为了进一步鉴定出陆地棉中GhBES1.4的结合motif，作者采用MEME中的CentriMo程序对DAP-seq数据进行motif分析。结果表明：陆地棉中，GhBES1.4与E-box和BRRE的结合均表现出较高的亲和力(Figure 2, A and C)。GhBES1.4与E-box结合频率为63%，而与BRRE的结合频率为16%。此外，在未报道的GhBES1.4识别位点(MEME-3/4/5)也显示有富集(Figure 2B)。

随后，为了验证DAP-seq鉴定到的motif是否真的GhBES1.4识别和结合被，作者将motif序列及其突变序列分别克隆到 pAbAi质粒中，并进行(Y1H)酵母单杂交。酵母在选择性培养基（Leu/+AbA）上的生长情况证实：GhBES1.4能与鉴定到5个的motif相互作用，但不能与突变序列结合(Figure 3A)。此外，生物膜层干涉（BLI）实验也证实GhBES1.4能识别这5个motif(Figure 3, B–F)。综上所述，作者认为：GhBES1.4可以与E-box结合，也可以与BRRE和Meme-3/4/5结合来调控靶基因的表达陆地棉中。

3. GhBES1.4靶基因参与多种细胞活动和生物学过程

作者DAP-seq鉴定对到GhBES1.4靶基因的进行GO富集分析，结果发现：陆地棉中GhBES1.4靶基因参与了一系列生物和细胞过程的调控，包括细胞发育、激素响应和防御机制。首先，作者利用陆地棉基因组注释信息来标注GhBES1.4靶基因的名称，并根据陆地棉中已报道的部分基因及功能、其它物种（如：拟南芥、水稻、小麦等）中同源基因及功能，构建出陆地棉中GhBES1.4的调控网络(Figure 4)。作者发现，GhBES1.4靶基因参与运输、代谢和信号转导等生物学过程。GhBES1.4还调控与细胞伸长、细胞骨架、细胞壁相关的基因。此外GhBES1.4，靶向多种激素相关的IAA、ABA、GA、JA和乙烯基因，包括，这说明GhBES1.4可能通过调控激素的合成以及激素间的相互作用来调节一系列细胞和生物学过程。最后，作者利用STRING数据库对GhBES1.4靶基因之间的关系进行了整合。

4. GhBES1.4调控与纤维伸长相关的基因的表达

为了进一步研究GhBES1.4在棉纤维发育中的功能，作者构建了GhBES1.4-OE / RNAi转基因植株，qPCR的结果表明：转基因植株的纤维中GhBES1.4的表达水平在GhBES1.4-OE中显著增加，在RNAi中显著降低(Figure 5, A and B)。与对照组相比，GhBES1.4-OE系的成熟纤维的长度增长了8.4%，而GhBES1.4-RNAi系的纤维长度（FL）减少了10.5%（Figure 5C)。

BR信号作为传导通路的核心转录因子BES1主要通过影响BR合成和信号，传导通路来发挥作用。因此，作者检测了GhBES1.4-OE和RNAi植株中BR相关标记基因GhCPD，GhCYP90D1和GhBRL的转录水平。结果显示，GhCPD、GhCYP90D1和GhBRL的转录水平在GhBES1.4-OE系中显著下调，而在RNAi系中上调(Figure 5, E–G)。综上所述，GhBES1.4参与BR介导的纤维伸长的正向调控。

随后，作者对来自野生型ZM24GhBES1.4-OE/RNAi转基因植株的10个DPA纤维进行了深度转录组和测序(RNA-seq)。GhBES1.4-OE与ZM24比较，共鉴定得到1,788个差异表达基因(Figure 6A)，而GhBES1.4-RNAi与ZM24比较，则鉴定得到1,566个差异表达基因(Figure 6B)。

基因聚类和KEGG富集分析结果表明GhBES1.4调控的差异基因在纤维发育过程中发挥多种功能，包括细胞壁伸长、原壁合成和微管蛋白组装。此外，在差异表达基因中，作者聚焦一些转录因子和功能基因（如WRKY，EXP，NAC，KCS和bHLH），这些基因参与长链脂肪酸的合成，细胞伸长，次生壁合成，细胞骨架组装以及其他与纤维伸长相关的过程 (Figure 6, C and D) ，这说明GhBES1.4直接或间接调控一些与纤维伸长相关基因的表达来促进纤维伸长。

5.GhBES1.4调控纤维伸长的转录网络

为了进一步鉴定受GhBES1.4直接调控的与纤维伸长相关的基因，作者对DAP-seq和RNA-seq数据进行了联合分析。其中，GhBES1.4-OE-DEGs和DAP-seq数据取交集，得到211个共有基因(Figure 7A)，而GhBES1.4-RNAi-DEGs和DAP-seq数据取交集，得到163个共有基因(Figure 7B)。

随后，作者结合这些基因的功能富集结果和已有报道，整合出GhBES1.4调控纤维伸长的转导网络，并利用STRING数据库预测了这些GhBES1.4靶基因之间的关联(Figure 7C)。由上述结果可知：GhBES1.4调控陆地棉纤维的伸长有着复杂的信号转导机制。

 

6.整合DAP-seq、RNA-seq和GWAS数据鉴定调控纤维伸长的GhBES1.4靶基因

为了进一步鉴定涉及调控纤维伸长的GhBES1.4靶基因，作者将FL的GWAS数据与DAP-seq数据进行了联合分析，结果鉴定到390个含有SNP位点的基因(Figure 8A)。接着，通过计算SNP位点FL的与相关性，作者筛选出35个与FL高度相关的基因(-logPvalue>5) (Figure 8, B and C)。随后，作者在RNA-seq数据中查看了这些基因的转录水平，发现有7个基因在两种转基因植株中差异表达(Figure 8 C)，并通过qPCR得到证实。

此外，作者利用生物膜层干涉技术证实DAP-seq鉴定的候选基因的启动子的motifGhBES1.4蛋白具有与结合200μM浓度下亲和力。,motif的启动子片段GhBES1.4有很强的结合能力，而与motif突变GhBES1.4结合的启动子片段不能与。LUC活性分析也GhBES1.4直接激活这表明，7个基因的启动子。上述结果表明，7个筛选出的GhBES1.4的直接调控基因确实受到。  为了阐明GhBES1.4促进棉纤维发育的机制，作者查询了7个候选基因的同源基因和家族基因的功能。其中，RVE5和HMG1参与细胞伸长，而CYP84A1参与细胞壁的合成，PP2CA、NCED1和ACS2分别参与ABA和乙烯的合成。作者推测7个基因可能通过调，这控上述途径来影响纤维发育。最后，作者验证了GhCYP84A1和GhHMG1基因的功能：GhCYP84A1和GhHMG1的沉默显著缩短了棉花的纤维长度(Figure 9)。

 

研究总结

1. 利用DAP-seq，作者鉴定得到9894个可能的GhBES1.4结合区域，在promoter区占比达17.17%。作者推测，GhBES1.4倾向于与启动子区DNA元件结合以调节基因表达。同时，作者筛选得到1,531个可能的GhBES1.4靶基因。BR标记基因，如GhCPD、GhDWF4和GhBRL已知的在靶基因中被鉴定到。
2. 利用MEME对DAP-seq数据进行motif分析，作者鉴定到5个可能的GhBES1.4结合motif，通过酵母单杂交和生物膜层干涉实验，作者证实：陆地棉中GhBES1.4主要与E-box结合，也可能与BRRE和Meme-3/4/5结合来调控靶基因的表达。
3. 联合DAP-seq、RNA-seq和GWAS数据，作者构建了陆地棉中GhBES1.4调控纤维发育的综合网络，具体机制概括为GhBES1.4与基因E-box启动子区的 motifACS2、RVE5、HMG1、MEFG2和CYP84A1的表达，结合，促进并PP2CA和NCED1的表达，从而促进乙烯合成、细胞伸长、细胞壁合成，抑制但ABA抑制的合成，最终促进纤维伸长(Figure 10)。