测序错误

 

二代测序技术（next-generation sequencing, NGS）在生物医学中已得到广泛的应用，如NIPT、WES全外显子测序、基因组重测序等。但NGS技术检测的准确性在1‰左右，在检测含量在1‰及以下的突变中，无法直接应用。如肿瘤患者血液中ctDNA的突变，含量在1%以下，通常在1‰~0.1‰的水平。在此水平下，NGS技术无法区分真实突变和检测错误，因此无法直接应用。

 

NGS检测结果的错误，可能由样本本身的DNA损伤、样本处理引入，更多的是在文库制备过程中的PCR扩增和测序过程中引入，后两个步骤的错误率可达0.6‰和1‰，如下表所示。

 

工作流程	错误来源	错误率
样本处理	DNA损伤，如8-oxoG
文库PCR扩增	早期掺入错误和聚合酶的偏好性	0.6‰ [1]
测序	测序错误	1‰

 

1. Johanna B , Mattias M , Charlotte H , et al. PCR-Induced Transitions Are the Major Source of Error in Cleaned Ultra-Deep Pyrosequencing Data[J]. PLoS ONE, 2013, 8(7):e70388

 

因此需要对NGS测序技术进行升级和改造，提高其准确性，从而满足更准确的检测需求。这就是DNA测序的纠错技术。目前有两大类主流的纠错技术，UMI分子标签纠错和双链纠错。双链纠错技术性能更为强大，可以过滤所有类型的检测错误；而UMI纠错对DNA损伤和扩增早期引入的错误则无能为力。

 

 

SMP：Stranded Multiplex PCR靶向测序技术

 

SMP是一种基于不对称多重PCR平台、同时又拥有双链纠错能力的靶向测序技术。其核心在于创新性的引入了3标签体系。该技术在每一个DNA双链分子的一端同时添加两种标记：一个UMI标记用于区分不同DNA，两个链分子标签（strand identifiers, SID）用于区分同一DNA的正链和负链。在单侧多重引物扩增之后，同一DNA的正链和负链带有相同的UMI标记，和不同的SID标记。分析时，通过UMI确定同一来源的DNA分子，再通过SID确定其链的来源，即可区分同一DNA分子的正链序列负链序列。通过和上文双链纠错相同的原理，通过还原正负链即可过滤掉所有的假阳性变异和检测错误。

 

 

 

 

SMP作为一种带有双链纠错功能的多重PCR的靶向测序技术，继承了多重PCR的所有性能优势，同时又克服了多重PCR技术检测准确性不足的问题，总结如下：

 

 

 

技术优势

 

1、高灵敏度、高特异性：

我们使用菁良科技的质控品GW-OCTM800对技术性能进行了验证，该质控品含有37个热点突变，突变频率为0%、0.005%、0.05%和0.5%。我们使用该质控品，进一步稀释，形成突变频率为0%、0.005%、0.02%、0.05%、0.1%和0.5%的6个梯度，选择了28个位点，使用SMP技术进行了21次的重复检测。我们使用了三种不同的纠错模式，对数据进行纠错：

 

>> SMP为3标签结构，与其他多重PCR技术比较，除UMI标签外，多了+/-链2个标签；我们仅使用UMI标签纠错，模拟其他的多重PCR技术；

>> SMP可以设计F/R引物对同一个位点进行检测，我们在UMI纠错的基础上，利用分子间双链（Duplex）纠错；

>> 使用正负链标签进行纠错（SID）

 

结果如下：

1、使用UMI纠错检测到最多的变异，Duplex纠错次之，SID纠错最少；但SID与Duplex纠错差异不大。

2、UMI纠错无法过滤掉所有错误，从0%样品（理论上无突变）可以发现，UMI纠错存在大量的假阳性；

3、Duplex纠错，可以大幅降低0%样品中的假阳性（34->8），但无法消除假阳性；

4、SID分子内双链纠错，可以完全去除0%样品中的假阳性；

 

 

对上述结果进行定量分析，发现：

1、SID纠错可以使检测的位点水平的Specificity达到100%，证明了SID分子内双链纠错强悍的纠错能力；

2、SID纠错在检测低频突变时会损失一定的Sensitivity：在含量为1‰及以上的位点中，SID纠错无Sensitivity损失；在检测万分之五含量的突变时，Sensitivity由29%（Duplex）降低为26%（SID）。

 

 

使用SID纠错，对数据进行进一步分析，发现SMP的检测限低于十万分之五：在特异性100%的条件下，对1‰及以上含量的突变灵敏度达到100%，万分之二的灵敏度高达64%，对十万分之五含量的突变，灵敏度仍高达26.7%。

 

 

2、定量准确：

通过计算标准品理论AF和检出AF的相关性分析，发现所有位点在万分之二及以上含量，定量表现出极高的线性关系，摘取部分结果如下：

 

3、业内最高的双链比例：

SID纠错最核心的指标是分子内双链的比例。如果该比例过低，使用SID纠错，虽然特异性可以得到保证，但会极大损害检出下限和灵敏度。我们上文提到我们在SID纠错，可以保证特异性100%的前提下，十万分之五含量的突变，灵敏度仍高达26%，原因就是我们的双链比例高。我们统计了20次重复实验分子内双链支持的比例，发现稳定在40%左右，部分高达50%。其他基于杂交捕获的双链纠错技术，双链比例平均在10%左右。

 

 

4、业内最高的灵敏度和特异性：

2021年，Nature biotechnology杂志比较了目前主流的ctDNA检测技术的性能，结果显示所有产品在检测0.5%及以下含量的突变时，灵敏度开始下降，低于100%。

https://www.nature.com/articles/s41587-021-00857-z

 

我们对28个位点、6个不同浓度的20次测试数据进行类似分析，结果表明SMP在保证特异性100%（SID纠错）的条件下，对0.1%以上含量的突变，检出率为100%。对0.05%和0.02%含量的突变，也保持了很高的检出率（90% vs 64%）。

 

 

5、快速、灵活、简单、稳定

 

与基于杂交捕获的检测技术比较，SMP省去了杂交捕获的步骤，因此在应用上具有巨大的优势：

1、建库流程简单、操作难度低、易于标准化：接头连接后，仅两步扩增和两步纯化的步骤；

2、实效性好：从DNA到文库仅需要7个小时的时间；

3、灵活性高：省去了杂交捕获样本pooling和浓缩的步骤，一个样品即可进行检测；

4、成本低：引物合成成本远低于探针合成成本，无捕获成本；