Nat Cell Biol：糖尿病疗法新靶点！

Nat Cell Biol：糖尿病疗法新靶点！
2023-04-21

 

 

 

HNF1A homeobox A (HNF1A)编码同源域转录因子，其单倍体剂量不足突变会诱发糖尿病。本研究通过小鼠和人类模型实验，发现HNF1A的反义lncRNA启动子--HASTER可以顺式调节HNF1A的转录，并通过正负反馈回路维持HNF1A的细胞特异性生理浓度。HASTER突变的小鼠胰腺β细胞表现出HNF1A沉默或过表达，从而导致高血糖。该研究揭示了一种不同于经典增强子或沉默子的顺式调节元件，它能稳定靶基因的转录，并能保证细胞特异性转录因子程序的准确性。这一发现有助于开发新型糖尿病治疗策略，对我们理解疾病中的非编码基因组缺陷也具有普遍意义。

 

 

研究思路

  1. HNF1A和HASTER在进化上保守性共表达

HNF1A-AS1是假定的非编码转录物，由HNF1A的1号内含子转录而并以反义构型起作用（下图a）。作者着重关注HNF1A反义转录物启动子的调节功能，将这段DNA序列命名为HASTER（HNF1A stabilizer）。作者通过CAGE-seq、RNA-seq和RACE证明HASTER转录了大量的转录本亚型，这些异构体起源于人类胰岛中的主要上游转录起始位点和其他组织中的下游起始位点（下图a）。

 两个转录起始位点都位于进化保守的序列中，这些序列在胰岛和肝脏中显示染色质启动子活性（高H3K4me3 和低 H3K4me1）(下图a,b)。HASTER仅在表达HNF1A的组织中表达，包括肝脏，肠道，胰腺和肾脏，并且在物种之间具有相同的反义构型(下图b)。

 

 

人β细胞的亚细胞分级显示，HASTER转录物与染色质相关，单分子荧光原位杂交显示，HASTER转录物仅存在于与HNF1A新生转录物共定位的一个或两个核焦点中（下图c)。

以上说明，HASTER转录了一种进化保守的核lncRNA，该lncRNA与HNF1A在组织中共表达。

 

  1. HASTER是HNF1A的负调控因子

为了研究HASTER功能，作者构建了一个缺失320bp HASTER启动子的人类胚胎干细胞（hESCs），并将其分化为肝样细胞(下图a)。在对照细胞中，HASTER转录产物在成肝细胞阶段表达量最高，而HNF1A在肝细胞成熟过程中逐渐上升（下图b)。在HASTER缺失细胞中，肝细胞HNF1A 表达量是对照的1.3-1.6倍（下图b）。这表明HASTER在体外人肝细胞模型中对HNF1A施加了负调节。

 

为了在体内检测这一功能，作者接着在Haster转录起始位点1.8kb两侧构建了LoxP位点（下图c)，并使用肝脏Cre转基因培育肝脏特异性Haster纯合缺失的小鼠模型（HasterLKO）。与人类突变细胞趋势一致，HasterLKO小鼠肝脏的Hnf1a mRNA和蛋白量都增加（下图d,f)。因此，HASTER对小鼠和人类肝细胞中的HNF1A都具有负调控作用。

 

  1. HNF1A是HASTER的正调控因子

为了检查HNF1A是否能反过来调节HASTER，作者构建了HNF1A缺陷细胞。HASTER在纯合Hnf1a无义突变小鼠的胰岛、肝脏以及HNF1A缺陷的EndoC-βH3人β细胞中显著下调(下图g-i)。

HNF1A部分敲低后，HASTER表达显著降低，而其他HNF1A依赖性基因如HNF4A表达量仅发生了微小变化，表明HASTER可能对HNF1A表达水平具有高度敏感性（下图a)。

与之相反的是，通过CRISPR-Cas9将Hnf1a 的mRNA上调约30-80%后，Haster RNA增加约50-120%（下图b)。

这些结果表明，HASTER启动子作为HNF1A调节因子发挥作用，它们之间存在一个负反馈回路，即HNF1A正调节HASTER，而HASTER负调节HNF1A。

 

  1. HASTER负反馈调控HNF1A初始转录活动

接下来作者用HasterLKO小鼠和对照小鼠的肝脏组织做了RNA-seq测序来研究上面反馈回路破坏的影响。GSEA分析结果显示处理和对照组上调或下调的基因具有相反的表达模式，而且处理组表达量上调最多的基因在肾脏或肠道中特异性表达（下图b，c)，说明Haster突变导致HNF1A依赖性肝脏基因的表达量增加，也会激活异位转录。

 

作者接下来通过chip-seq检测了HasterLKO小鼠肝脏中HNF1A的基因组结合状况。与对照相比，HasterLKO组有325个peak上调，且有105个新结合位点（下图d-f)。

研究表明，HNF1A在体外能与核小体DNA结合，可激活成纤维细胞中受抑制的肝脏基因，并将其重新诱导为肝细胞。HNF1A新结合位点在正常肝脏中没有显示出染色质可接近性（下图e,f)，但在HasterLKO肝脏中显示出经典的染色质修饰（H3K4me3和H3K27ac）(下图g），说明HasterLKO肝脏中HNF1A的增加导致新结合位点的产生，从而形成新的活性染色质区域。

总之，HASTER反馈回路的遗传破坏导致细胞内HNF1A浓度增加，从而引起现存HNF1A结合启动子的过度激活或沉默染色质的启动子活化（下图i）。

    

这表明，HASTER反馈对于控制HNF1A激活以及微调HNF1A依赖性转录程序的组织特异性至关重要。

 

  1. HASTER失活导致糖尿病

已知HNF1A单倍体不足会导致胰腺β细胞功能障碍和糖尿病，为了检测胰腺细胞中的Haster，作者用Pdx1-Cre转基因切除所有胰腺上皮谱系中的Haster后得到HasterpKO小鼠模型，雄性HasterpKO小鼠在正常发育8周后会表现出明显的高血糖、低胰岛素等糖尿病症状（下图a,b)。种系突变小鼠 (Haster−/−)出生率和表现都正常，但同样患有糖尿病、葡萄糖不耐受和低胰岛素血症（图c–e）。因此，种系或胰腺中Haster失活会导致胰岛素分泌受损和糖尿病。

 

 

  1. 敲除HASTER引起胰岛细胞中HNF1A的诱导或沉默

HasterpKO 和Haster−/−胰腺在所有腺泡细胞和众多内分泌细胞中显示出HNF1A免疫反应增加（下图f)。为了进一步了解胰腺HNF1A表达的Haster依赖性调节，作者分析了小鼠不同发育阶段缺失Haster的情况。在胚胎阶段，大多数Haster−/−多能胰腺祖细胞显示出明显的异质性HNF1A表达，许多细胞显示出低或无HNF1A的表达，而HNF1A在周围的原始肠道细胞中的表达是均匀的（下图g）。因此，在胰腺中Haster也是Hnf1a的负调节因子。Haster失活在β细胞中能引起HNF1A特异性表达表型，并有沉默和过表达共存的现象，表明Haster对β细胞功能和葡萄糖稳态至关重要。

 

  1. Haster缺陷型胰岛细胞转录组的变异

作者对HasterpKO 和对照小鼠的胰岛细胞进行了单细胞转录组测序，并对细胞类型进行了分型。HNF1A调控基因在HasterpKOβ细胞中的变异性增加，这与HasterpKOβ细胞中HNF1A表达趋势一致（下图h)。并且大部分HasterpKO的β细胞显示出HNF1A调控基因的表达增加，而HNF1A-low组的β细胞中，对HNF1A依赖性基因的强烈下调，如Ttr、Tmem27、Slc2a2和Kif12(下图e)。因此，Haster突变会导致胰腺β细胞功能性HNF1A缺乏，或使HNF1A依赖性基因过表达。表明Haster能确保β细胞HNF1A调节程序的稳定性。

 

 

  1. HASTER调控人胰腺祖细胞中的HNF1A

   作者后续又测试了人类胰腺祖细胞中的HASTER功能，用HASTER P1缺失的hESC克隆生成胰腺祖细胞，HASTER敲除的胰腺祖细胞显示HNF1A mRNA减少62%，并且异质性的HNF1A蛋白水平较低（下图j,k)，这与肝分化后显示HNF1A mRNA增加的结果相反，表明HASTER在胰腺祖细胞中也能作为HNF1A的正调控因子。

 

  1. HASTER启动子顺式激活HNF1A

接下来，作者探讨了HASTER如何对HNF1A进行正调控和负调控。为了评估HASTER是顺式还是反式作用，作者培育了Hnf1a+/-;Haster+/-小鼠模型。与人类Hnf1a突变相反，单一杂合子的小鼠不会出现高血糖的症状（下图a)。复合杂合子小鼠表现出明显的高血糖伴低胰岛素血症，但在纯合Hnf1a突变的小鼠中在胰腺之外没有明显特征，在这一过程中大多数10周龄Hnf1a+/-;Haster+/-小鼠β细胞中都伴随着HNF1A的表达缺失（下图b)。由于野生型Haster等位基因不能激活野生型Hnf1a，杂合Haster无效等位基因小鼠上胰岛Hnf1a表达降低，这表明在胰岛细胞中Haster可以顺式正向调节Hnf1a(下图c)。因此，Haster以顺式作用维持胰岛β细胞中Hnf1a的表达。

 

  1. HASTER顺式抑制HNF1A

那么HASTER是如何对HNF1A进行负调控的呢，作者再次检测Hnf1a+/-;Haster+/-小鼠的肝脏，发现Haster缺失会导致HNF1A表达上升。复合杂合子表明Hnf1a在肝脏细胞中升高，表明携带Haster缺失的染色体中Hnf1a+等位基因的表达增加不能被Hnf1a-;Haster+等位基因补偿（下图e)。在杂交Haster+/-小鼠肝脏中，Hnf1a在Haster突变的染色体中选择性增加（下图f)。这表明与激活相同，HASTER依赖性顺式抑制HNF1A。

 

  1. HASTER启动子对抑制HNF1A至关重要

确认了HASTER对Hnf1a的顺势调控作用之后，作者把重点放在检测HASTER转录延伸、RNA或其启动子在这种顺式抑制功能中的作用。Hasterstop杂合品系小鼠的检测结果表明，启动子引起的转录阻断不会导致肝脏中Hnf1a 1号外显子转录增加（下图g)。

为了研究HASTER转录的作用，作者将Cas9靶向HASTER转录起始位点，或者位于HASTER和HNF1A启动子之间的一个控制内含子区域（图5h)。结果表明，靶向HASTER启动子抑制了HASTER RNA的形成，但不影响HNF1A mRNA或HNF4A（HNF1A依赖性转录基因）。反过来，小鼠或人β细胞系中CRISPR–dCas9–SAM激活会导致HASTER转录使其RNA水平增加五倍以上，而不会改变HNF1A或HNF4A mRNA（图5i）。因此表明，HASTER启动子而不是转录调节或转录延伸对HNF1A产生抑制作用。

 

 

  1. HASTER抑制HNF1A需要HNF1A结合到HASTER

前期遗传学研究表明HNF1A依赖的HASTER转录与HNF1A负调控之间存在密切相关性。为了弄清这一点，作者通过慢病毒四环素诱导过表达HNF1A来激活HASTER（下图a）。除了HASTER上调以外，作者还发现内源性HNF1A mRNA降低了十倍。并且在敲除HASTER启动子后，HNF1A过表达的抑制作用几乎完全消除（下图b）。这表明，HNF1A的抑制是由HNF1A与HASTER启动子DNA 的相互作用特异性触发的，而不是由影响HASTER转录的其他操作引起的。

 

结论

本研究发现了一种能感应HNF1A浓度并能实时反馈以确保其细胞特异性表达水平的顺式调节元件，它是一种不同于增强子和沉默子的顺式作用稳定剂，能通过双重激活和抑制开关防止作用对象过度表达和沉默（下图）。这一发现为剖析HNF1A单倍型糖尿病的细胞特异性遗传机制提供了线索。

 

Beucher, A., Miguel-Escalada, I., Balboa, D. et al. The HASTER lncRNA promoter is a cis-acting transcriptional stabilizer of HNF1A. Nat Cell Biol 24, 1528–1540 (2022). https://doi.org/10.1038/s41556-022-00996-8

创建时间：2023-08-17