新冠肺炎患者TCR和BCR二代测序揭示与疾病严重程度相关特征

 

研究背景

疫情初期，关于SARS-CoV-2诱导的T细胞和B细胞免疫应答的性质及其调节因素还没有彻底了解，尚不清楚轻度和重度新冠肺炎患者对SARS-CoV-2的免疫应答有何差异。本研究作者利用TCR/BCR测序技术，结合抗体诊断、细胞因子分析和流式细胞术，分析了新冠肺炎感染期或康复后患者的适应性免疫特征，并创建了一个超过1400万个B和T细胞受体（BCR和TCR）序列的存储库。这些数据提供了对SARS-CoV-2适应性免疫的基础性了解，为治疗理念和疫苗开发提供了资源。同时也为其它类似疾病的研究提供了很好的基础支撑。

 

研究结果

1. 人群和实验特征

首先，作者根据新冠肺炎的疾病特征对感染人群进行了分类假设，轻度至中度病程和早期康复的患者在感染后血液中具有有效免疫控制和持久免疫受体特征，而重症甚至致命的新冠肺炎患者表现出炎症反应并且无法诱导早期保护性免疫。基于这一假设，研究者编制了新冠肺炎后恢复的患者队列（队列1，n=19名患者，n=20份样本）和感染中患者队列（队列2，n=20患者,n=50份样本）。作为参考，加了一个年龄匹配的健康供者（HD）队列，该队列新冠肺炎抗体检测为阴性（n=39）。患者队列1和2的病程下图所示。

 

随后，研究者对实验人群的免疫体系进行了系统了解：许多感染中（且大多为重度）新冠肺炎患者出现白细胞增多，一些患者出现粒细胞增多和明显的T细胞减少，而大多数患者的B淋巴细胞计数正常，甚至增加（下图A-E）；CD4⁺：CD8⁺T细胞比率向CD4⁺T细胞转移（下图F），一些患者的调节性T（Treg）细胞扩增（下图G）；免疫球蛋白G（IgG）和IgM浓度正常或降低（下图H）。

 

通过ELISA测定发现，感染SARS-CoV-2的所有患者中，大部分患者（32/37）在某个时间点显示抗SARS-CoV-2 IgA和IgG阳性（下图I和J）。血浆中和试验呈阳性的占比更高（35/37）下图K）。半定量ELISA测定显示，感染期新冠肺炎患者的抗SARS-CoV-2抗体峰值通常高于恢复期患者（下图I）。在症状发作后几天至8周之间通过ELISA分析的70个时间点中，48个IgA和IgG阳性，12个IgA或IgG阴性，6个IgG阴性但IgA阳性，只有3个IgG阳性但IgA阴性（下图I、J和L）。

 

2. 新冠肺炎患者持续性细胞因子紊乱和I、III型干扰素应答

作者推断，先前报道的新冠肺炎中的细胞因子风暴可能导致这些患者的某些血液计数异常。IL-6和IL-10既参与类别转换重组，也参与T细胞衰竭，在感染新冠肺炎患者的血浆中显著增加，而康复患者的浓度正常（下图A）。

此外，在感染中新冠肺炎患者中，B细胞激活因子（BAFF）的血浆浓度明显升高，并且与B细胞计数呈非常不寻常的正相关，而增殖诱导配体（APRIL）仅在康复患者的血浆中升高（上图A）。抗病毒细胞因子模式与IFN I型和III型响应相一致，后者在新冠肺炎的恢复期持续增加（下图B）。

新冠肺炎对免疫检查点分子的分泌变体有强烈影响，如可溶性Tim-3（sTim-3）、sLAG-3、sCD25和sGalectin-9，这些分子在恢复阶段是正常的，表明在疾病感染期（和重症期）存在大量抗病毒反应和反调节（下图C）。

 

3. 新冠肺炎早期CD4⁺和CD8⁺T细胞激活和反调节，向T卵泡辅助因子、Th17和非常规Th1细胞响应转变

基于SARS-CoV-2对T细胞数量、CD4⁺：CD8⁺比率和分泌性免疫检查点分子的影响，作者通过多参数流式细胞术对新冠肺炎患者T细胞的功能状态进行研究。对感染期患者出现症状后2周至1个月的数据进行分析。无监督聚类分析明确显示新冠肺炎患者T细胞中存在2个差异丰富的簇（DAC）（下图A）。这两个簇都含有表达共抑制受体的细胞，即BTLA（B和T淋巴细胞衰减器）、程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）和全新免疫检查点TIGIT。

对每个淋巴细胞亚群中共抑制受体表达的进一步分析证实，与对照组相比，CD4⁺和CD8⁺ T细胞中BTLA均显著上调（下图B和C），表明两个亚群中的T细胞活化和反调节。虽然Tim-3上调似乎是CD8⁺亚群更重要的激活检查点，但PD-1上调在CD4⁺亚群更为明显，同时代谢激活的-5’-胞外核苷酸酶CD73也明显下调，它也参与了病毒免疫应答期间先天免疫激活的调节（下图B和C）。

此外，与抗病毒反应密切相关的自然杀伤（NK）细胞有明显的去抑制迹象（上图B和C）。相比之下，新冠患者体内原始和不同阶段记忆细胞的比例没有明显变化（下图E)，说明在感染期和重症期新冠肺炎感染患者中，T细胞响应仍处于免疫激活的早期阶段。

 

 

4. 建立新冠肺炎患者B和T细胞受体序列库

通过以上对样本血液B细胞和T细胞亚群及抗体库的分析，揭示了新冠肺炎不同以往的免疫响应。作者认为揭示保护性和有害B和T淋巴细胞反应的本质可被用作患者的预后生物标志物，是开发SARS-CoV-2单克隆抗体的关键，也是确定疫苗开发的最佳T细胞参与策略的关键。为此，他们创建了一个不断更新的新冠肺炎BCR和TCR序列库。该储存库包含总共37名患者的序列，包括69个时间点，以及从该储存库中检索到的用于本文分析的序列，BCR>620万，TCR>830万。

 

5. 新冠肺炎患者B细胞对含IGHV3重组响应的收敛性

总的IGH指标显示，新冠肺炎患者中IGH序列的多样性和丰富程度都更高，尤其在康复病例中尤为明显（下图A）。总的来说，与HD相比，在新冠肺炎患者的序列库中，IGH体细胞超突变仅出现非常轻微的增加（下图B）。为了研究与此相关的潜在临床意义，作者比较了需要机械通气或ECMO的危重症患者与在疾病过程中不需要任何通气支持的住院患者的体细胞变异BCR率。分析表明，临床重症患者携带高频突变BCR体细胞的比例更高（下图B）。说明体细胞高频突变是一种更严重的临床表现相关的模式。是免疫系统为了应对从未遇到的抗原而产生的一种机制。

 

接下来，作者通过分析保守序列的特性来展示新冠患者之间B细胞反应的共有特征，从而降低用于识别SARS-CoV-2抗体BCR库的复杂性。为了实现这一点，作者从两个队列中随机选择了13个抗体阳性（IgG和IgA），6个对照（SARS-CoV-2 IgG或IgA阴性），获得了每个样本最常见的50个BCR克隆型，并对这19个样本进行了系统发育分析（下图C左）。其中只有10个克隆型和4位患者的B细胞簇被认为可能是靶向抗体的潜在来源。为了评估聚类方法的特异性，作者又选择了阳性和阴性对照队列。阳性对照包括13个埃博拉病毒免疫疫苗28天后产生抗体的样本和未产生抗体的5个样本（下图C右下）；阴性对照包括19个随机选择的来自HDs的BCR库（下图C右上）。系统发育分析显示，新冠患者中不同个体参与了非常相似的B细胞反应，表现为优先使用Ig重链可变区3（IGHV3）亚家族基因，且大多数与IGHJ4或IGHJ6基因片段重排。

 

相比之下，埃博拉队列中的疫苗特异性集群显示IGHV基因的使用更分散，而大多数新冠肺炎特异性IGHV3 BCR簇包含未突变的BCR序列（上图C）。这表明对SARS-CoV-2具有更有效免疫应答的患者拥有更大的原始B细胞池。另外，研究者还在8名不同的患者中检测到5种特异性B细胞克隆型，这与前人分离的抗SARS-CoV-2单域抗体（n3010）非常相似。这些序列也偏向于IGHV3和IGHJ4基因的使用，并表现出低水平的体细胞超突变，与种系V基因的同源性为98%–100%（上图D）。这一结果表明：IGHV3驱动的BCR簇与SARS-CoV-2抗体密切相关。

 

6. 患者之间共享新型冠状病毒特异性T细胞簇

在新冠肺炎感染过程中，T细胞具有高度克隆性，而随着T细胞再生过度，T细胞的多样性和丰富度高于恢复期HD的水平（下图A）。新冠肺炎患者的T细胞受体β链可变和连接（TRBV/J）基因的使用严重扭曲（下图B）。

 

作者使用GLIPH2算法基于假定的相同抗原识别对TCR序列进行聚类。另外，计算簇中所有T细胞克隆型的产生频率（pGen），具有高频的T细胞克隆型为公共克隆型，低pGen集群被认为是私有克隆型。因此，如果几个个体之间共享低pGen序列，则可假定它们是针对特定触发因素的定向免疫反应中产生的。在感染期和大多数严重病例中富集的簇主要包是公共克隆型（下图C，左图，左下象限和红点），只有少数低pGen簇有富集（下图C，左图，右上象限）。相比之下，康复队列中存在大量的特异性簇（n=2331；下图C，左图，绿色圆点），包括31个低pGen簇。值得注意的是，pGen最低为2^-51，序列基序为“S-GGTGYE”的簇仅在3名康复患者中特异性共享（下图C，右图）。因此，患者在感染到恢复的过程中出现明显共享特异性T细胞簇的特征。

 

 

小结

本研究的重要结论：

1. IGHV3驱动的BCR簇与SARS-CoV-2抗体密切相关。
2. 新冠肺炎患者康复过程中出现共享T细胞簇
3. 建立了新冠肺炎患者受体序列库供公众使用

研究的局限性：

1. 缺乏重症患者感染早期的血样。这些样本可以验证本研究结果对早期疾病诊断的重要性。
2. 需要更大的数据集去分析某些HLA类型对新冠肺炎易感性或疾病严重性的影响。

 

对T细胞和B细胞在疾病过程中免疫响应进行系统研究，一方面，有利于加速我们对新冠肺炎患者预后免疫反应的掌控，以便更好地监测和诊断；另一方面，对疫苗研发和治疗方法的开发提供有力支撑。

 

参考文献

[1] Schulthei C ,  Paschold L ,  Simnica D , et al. Next-Generation Sequencing of T and B Cell Receptor Repertoires from COVID-19 Patients Showed Signatures Associated with Severity of Disease[J]. Immunity, 2020. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2020.06.024