SF3B1促进HIF1信号转导和胰腺癌的恶性发展

SF3B1促进HIF1信号转导和胰腺癌的恶性发展 

 

研究背景

SF3B1U2小核核糖核蛋白(snRNP)复合物的核心成分,参与RNA剪接中分支点序列的识别和选择。该基因的错义突变常见于多种不同的血癌(例如,骨髓增生异常综合征、慢性淋巴细胞白血病)和实体瘤(例如,乳腺癌、胰腺癌、葡萄膜黑色素瘤)中,导致异常的3’剪接位点被使用,从而产生新的 isoforms/或导致数百个基因发生无义介导的衰减。而如MAP3K7PPP2R5A等基因的错误剪接则被证明会促进肿瘤的恶性发展。同时最近的研究还发现,野生型SF3B1表达水平与胰腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、肝癌和乳腺癌的侵袭性之间存在联系,SF3B1较高的表达与不良预后相关。考虑到心脏中,SF3B1过表达是由缺氧诱导的,而实体瘤通常含氧不足,因此作者假设野生型 SF3B1表达上调有助于肿瘤细胞适应缺氧状态,并促进肿瘤的发展。为了验证猜想,ChIP-seq作者利用开展了如下实验。

 

研究结果

 

1.SF3B1HIF靶基因,可正向调控HIF通路活性

之前的研究中作者观察到在缺血性心脏病中SF3B1HIF信号通路调节。因此,作者猜测在癌症中SF3B1同样可能是HIF靶基因,于是作者首先分析了胰腺导管腺癌 (PDAC)、前列腺癌(PCA)、肝癌(HCC)和乳腺癌(BRCA)四种不同实体瘤的RNA-seq数据,结果显示SF3B1表达与HIF信号传导的两个关键成分HIF1AARNTHIF1B)密切相关(Figures 1A and 1B),并且SF3B1表达越高的患者生存期越短 (Figure 1C)

接着作者专注于PDAC(该癌症类型因缺氧环境闻名),并在人PDAC样本中观察到34个已知HIF靶基因的平均表达与SF3B1表达之间存在较强的相关性( Figure 1D)。随后作者使用一组患者来源的PDAC类器官和细胞系,在实验诱导缺氧条件下检测到SF3B1的表达显著上调 (Figures 1E)。此外,ChIP-qPCR结果显示:PANC-1细胞中HIF1α结合到SF3B1的启动子区域(Figure 1F),上述结果表明:PDAC中,SF3B1HIF靶基因

最后作者对SF3B1是否还是HIF1信号传导的调节因子进行了验证,通过过表达、siRNA介导的敲低和单等位基因敲除等手段调控人PDAC细胞系和患者来源PDAC类器官中SF3B1的表达水平,结果表明:SF3B1的过表达导致基于VEGF-荧光素酶HIF报告基因活性以浓度依赖性方式增加 (Figures 1G),并且已知HIF靶基因(BNIP3CA9EGLN3GLUT1VEGFA)的表达上调(Figure 1H),而SF3B1表达水平的降低则导致这些靶基因显著下调(Figure 1H)。此外,在对缺氧敏感的Mia-Pa-Ca-2细胞中,SF3B1的过表达增加了缺氧状态下细胞的增殖率,而在正常氧状态下却没有发现该现象 (Figure 1I)。同样,SF3B1的敲低也导致黑色素瘤、BRCA和嗜色性肾细胞癌(ChRCC)细胞系中HIF靶基因响应显著降低。综上所述,作者发现SF3B1不仅是HIF靶基因,而且HIF1信号传导的调节因子

 

2.SF3B1HIF1α发生物理性相互作用

众所周知,SF3B1是一种剪接因子。作者推测SF3B1水平降低会导致HIF1亚基的错误剪接从而影响缺氧信号传导。为了验证该猜想,作者分析了siRNA介导的SF3B1敲低的PANC-1细胞中HIF1AHIF1B的剪接情况,结果显示SF3B1表达下调,HIF1A的剪接没有发生改变,但HIF1Bisoform发生由变体1到变体3的转变,缺失框内外显子5。随后,作者在SF3B1耗尽的AsPC-1-BxPC-3-PANC-1细胞中过表达isoform 1但没能挽救HIF靶基因的活性,并且pladienolide BSF3B1剪接活性的特异性抑制也没有导致缺氧诱导下PANC-1细胞中基于VEGF-荧光素酶的HIF报告基因活性降低。这些结果表明:SF3B1通过不依赖剪接的方式调控HIF信号传导

免疫共沉淀Co-IP结果表明,在缺氧条件下,SF3B1HIF1α/HIF1β转录复合物结合 (Figures 2A and 2B2A使用SF3B1抗体,2B使用HIF1β抗体)。虽然特异性siRNA介导的SF3B1耗竭并不影响HIF1βHIF1α的结合(Figures 2C2C使用HIF1α抗体),但siRNA介导的HIF1α耗竭却阻止了SF3B1HIF1β的免疫共沉淀(Figures 2D2D使用HIF1β抗体)。这些数据表明,SF3B1通过HIF1αHIF1α-HIF1β异源二聚体相互作用,但这种结合对于HIF1α-HIF1β异源二聚体的形成并不重要。

接着作者借助Sf9真核表达系统纯化重组链球菌标记的SF3B1HIF1αHIF1β蛋白,混合后分别用HIF1αSF3B1抗体进行IP实验,结果显示:无论HIF1β是否存在,SF3B1HIF1α都能发生免疫共沉淀 (Figures 2E and 2F)

    为了确定HIF1α介导SF3B1结合的相关域,作者生产了一系列血凝素(HA)标记的HIF1α缺失突变体,并将其与内源性SF3B1进行免疫共沉淀 (Figure 2G)。结果表明,bHLH-PAS-A-PAS-B结构域对于HIF1αSF3B1形成复合物是必要的(Figure 2H)。此外,当使用HA标记的SF3B1缺失突变体与内源性HIF1α进行免疫共沉淀时,作者发现SF3B1HEAT重复序列与HIF1α发生强烈相互作用,但N端结构域则没有(Figures 2I and 2J)

最后,作者还从缺氧的HEK293细胞中免疫沉淀SF3B1HIF1α,并通过免疫印迹检测U2 snRNAP复合物的核心组分的存在。作者发现只有SF3B1,而非HIF1α,印迹出U2组分SF3B2SF3B4SF3B14 (Figure 2K)。以上结果说明,SF3B1通过结合HIF1α而与HIF1复合物发生物理相互作用,从而调控HIF信号传导

 

3.HIF1HRE元件结合需要SF3B1参与

亚细胞蛋白分离实验结果表明,siRNA介导的SF3B1的敲低导致染色质结合的HIF1α减少,但HIF1α总量不受影响 (Figures 3A)。而ChIP 实验结果则显示:缺氧条件下SF3B1会与各种 HIF靶基因的缺氧响应元件(HRE)结合,而在敲低HIF1α后结合被解除。同样,在HEK293PANC-1细胞中,siRNA介导的SF3B1耗尽后,HIF1αHIF1βHREs的缺氧依赖性结合显著降低。

为了更深入地评估HIF1 DNA结合对SF3B1的依赖性,作者对用SF3B1靶向siRNA或对照siRNA处理的缺氧PANC-1细胞进行了HIF1α ChIP-seq,并在三个对照重复中鉴定到740个高信度Peaks。其中,有192Peaks定位于在缺氧PANC-1细胞中转录上调的基因附近(±3 kb) (Figure 3B)10个最明显的peaks中有6个位于已知的HIF1靶标ENO1