20220826文献解读 | ChIP-seq与RNA-seq联合：RUNX2转录因子驱动人循环NK细胞的产生并促进向组织常驻NK细胞分化

自然杀伤(NK)细胞是一种先天免疫的淋巴细胞，通过细胞毒作用和分泌细胞因子来清除病毒感染的细胞和癌细胞。除了循环NK细胞外，在不同的器官中也发现了不同的组织常驻的NK亚群。尽管调节NK细胞发育和功能的转录因子已经在小鼠中得到了广泛的研究，但无论是在小鼠还是在人类中RUNX2在这些过程中的作用还没有被广泛研究。因此作者利用ChIP-seq和RNA-seq技术联合分析等展开了相关研究。

一、 RUNX2可以促进人类成熟NK细胞的产生

作者首先用流式细胞术分析了人类HSC（造血干细胞）和健康供者骨髓、扁桃体或外周血中NK细胞发育的1-5期的RUNX1、RUNX2和RUNX3的蛋白表达情况，结果显示RUNX1在早期分化阶段表达水平最高，而RUNX3则相反；至于RUNX2，NK祖细胞分化到Stage1和Stage2阶段时达到表达峰值，随后降低，这些结果与之前研究报道的结果一致。

RUNX2的表达受到两个启动子控制，两个启动子产生两种RUNX2的isoform：近端启动子产生I型(RUNX2-I)；而远端启动子产生II型(RUNX2-II)，如下图B所示。作者接着对ATAC-seq和H3K27ac/H3K4me3 Chip-seq数据进行分析，结果显示与RUNX2-II的远端启动子相比，RUNX2-I的近端启动子区域在HSCs和NK细胞中染色质可及性更多，即RUNX2-I是主要调控NK细胞的发育的转录因子。

为了确定RUNX2在人NK细胞发育中的作用，作者构建了RUNX2特异性shRNA诱导敲除细胞系和CB来源的HSC中异位过表达RUNX2-I细胞系，利用qPCR和流式分析证实RUNX2基因敲除抑制NK细胞的发育，而过表达则会加速成熟NK细胞的生成。（如下图）

二、 RUNX2可能通过调控IL-2Rβ表达水平来控制NK细胞的发育过程

根据之前的研究表明NK细胞在发育过程中强烈依赖IL-15信号传导过程，其中IL-2Rβ（ IL-15受体的亚基）起着关键作用。那么NK细胞的发育和IL-2Rβ之间又有何种关系呢？作者做了以下研究：

在RUNX2敲低和过表达培养物的第7天和14天，通过流式细胞术测定处于Stage3阶段NK祖细胞中IL-2Rβ+细胞的出现频率（如下左图所示），dot plot（下右图）则显示处于Stage3的NK祖细胞的代表性的marker：CD117与IL-2Rβ染色。这些结果证明了RUNX2-I过表达显着增加了IL-2Rβ+ NK定向祖细胞的出现频率，在过表达培养14天后或 RUNX2敲低培养7或14天后均未检测到显着差异。

随后作者对数据库中已有的RUNX2 ChIP-seq数据进行分析，发现RUNX2可以通过结合IL2RB基因的启动子区从而提升IL-2Rβ表达水平致使培养中的NK祖细胞数量增加(如图B)。为证实RUNX2直接调节IL-2Rβ的表达，作者将RUNX2敲低和过表达载体分别在 YTS 和ALL-SIL细胞系中转导。在转导后4天，用流式细胞术检查 IL-2Rβ的表达(如图C）。这些结果共同表明RUNX2可能通过直接诱导IL-2Rβ表达促进NK细胞分化，从而维持NK谱系分化的命运。

三、RUNX2促进组织常驻NK细胞表型的获得

为了进一步研究RUNX2介导NK细胞分化的分子机制，作者进行RUNX2 ChIP-seq和RNA-seq，共鉴定出12121个Peak,其中大部分位于靶基因的启动子区域（如图A)，RUNX家族的motif（如图B）中最丰富。

ChIP-seq和RNA-seq的联合分析结果表明，大多数差异表达的基因都是RUNX2的直接靶标，突显了RUNX2调控NK细胞分化过程的重要性。

根据RNA-seq分析，与组织常驻NK细胞和归巢相关的基因产生表达量的变化(如图D)。使用这些基因集进行GSEA分析，证实RUNX2在NK细胞出现组织常驻表型中的关键作用。（如图E)

为了进一步证实RUNX2在人类trNK细胞的发育过程中发挥着重要作用。作者使用流式细胞术分析了归巢标记及NK细胞受体，结果显示RUNX2的过表达和敲除会影响到NK细胞发育相关的靶基因表达（如下图）。

四、RUNX2在细胞毒性中没有作用，但可以抑制细胞因子和效应分子的产生

RUNX2基因的敲除和过表达对细胞毒性无明显作用，但是对细胞因子和细胞毒效应分子的产生产生抑制作用。TNF-α和效应分子直接受RUNX2调控。 

五、体内验证RUNX2在NK细胞组织常驻中作用

作者为了确定RUNX2是否在体内NK细胞发育和体内组织驻留中发挥作用，通过静脉注射脐带血来源的造血祖细胞(HPC)到致死性照射的NSG-HuIL-15小鼠中，从而建立了人源化的小鼠模型(如图A）。

与注射对照HPC的小鼠相比，注射沉默RUNX2的HPC的小鼠各个器官的NK细胞数量显著减少(如图B所示），证实体内RUNX2也是NK细胞发育所必须的转录因子。

组织常驻NK细胞在骨髓和固有肠板组织中出现频率显著降低，而循环NK细胞的占比增加（如图C)，这表明在这些器官中，RUNX2参与调控NK细胞组织常驻表型。

1. 作者通过分析数据库中ATAC-seq，H3K4me3和H3K27ac ChIP数据证明RUNX2-I isoform是NK细胞发育过程中主要表达的转录因子类型；

2. 过表达NK祖细胞中IL-15的受体IL-2Rβ，辅以数据库中RUNX2的ChIP数据发现RUNX2可以通过结合IL2RB基因的启动子区来调控其表达水平；

3. 作者同样对NK细胞进行RUNX2 ChIP-seq和RNA-seq，证明RUNX2在NK细胞发育成组织常驻表型的作用。