IF 24.3|院士团队最新成果解读：ESCC耐药怎样拓展研究？
IF 24.3|院士团队最新成果解读：ESCC耐药怎样拓展研究？
食管鳞状细胞癌（ESCC）是世界范围内常见、死亡率极高的食道癌类型。目前，主要使用铂类化疗药物对ESCC患者进行治疗。但由于化疗耐药，导致治疗失效和肿瘤转移时常发生。ESCC顺铂耐药的分子机制尚未明确。
2024年5月，中国医学科学院肿瘤医院赫捷院士团队在Drug Resistance Updates（IF 24.3）发表题为“KLF12 Interacts with TRIM27 to affect Cisplatin Resistance and Cancer Metastasis in Esophageal Squamous Cell Carcinoma by regulating L1CAM Expression”的研究文章，揭示了TRIM27/KLF12-L1CAM调控ESCC顺铂耐药和肿瘤转移的分子机制，为ESCC治疗提供新的潜在靶点。
整篇文章干湿结合、验证扎实，值得疾病耐药研究的同学们借鉴学习，特别是KLF12结合伴侣的鉴定以及基于TRIM27功能延伸到泛素化的研究拓展，让人眼前一亮。康测科技为本研究提供ChIP-seq测序分析服务。
为了探究ESCC化疗耐药的机制，作者首先构建了PDX模型(Fig. 1A)，并对其中化疗耐药和化疗敏感模型进行了RNA-seq分析。结合TCGA数据库，作者发现KLF12在化疗敏感模型中高表达，并与ESCC患者良好的生存预后相关（Fig. 1B和1C）。
为了探究KLF12表达与ESCC顺铂耐药的关联，作者在KYSE30和KYSE70细胞中敲低KLF12，但在KYSE150细胞中过表达KLF12。体外/内实验表明敲低KLF12显著增强ESCC顺铂耐药（Fig. 1G-1K），而过表达KLF12则增强ESCC对顺铂的敏感性。
为了探究KLF12影响ESCC顺铂耐药的分子机制，作者分别对KLF12敲低和对照细胞、KLF12过表达和对照细胞进行了RNA-seq。结合韦恩图筛选 (Fig. 2C)、qRT-PCR和WB验证(Fig. 2D和2E)，作者发现KLF12显著抑制L1CAM表达。
考虑到KLF12可能作为转录因子，调控L1CAM的转录。作者首先对已发表的、来自HEK293和HepG2细胞的KLF12 ChIP-seq数据进行分析，并在L1CAM上发现两处KLF12结合位点(Fig. 2F)。随后，作者利用ChIP-qPCR (Fig. 2G)在HEK293和KYSE30细胞中加以证实。
为了鉴定KLF12在L1CAM上具体的结合位点，作者首先利用de novo motif分析，在L1CAM 5’UTR上游鉴定到(GCCC)n和(GGGC)n motif（promoter1），在exon 1上游鉴定到GGGC-rich motif（promoter2）（Fig. 2H和2I）。接着，通过突变&荧光素酶实验(Fig. 2I-2K)、EMSA验证，作者证明KLF12可以通过结合L1CAM promoter1/2来抑制L1CAM转录。
3、KLF12通过调节L1CAM的表达来影响ESCC顺铂耐药和肿瘤转移
为了进一步验证KLF12-L1CAM-ESCC顺铂耐药的关联，作者在KYSE30细胞中过表达L1CAM。体外/内实验表明过表达L1CAM增强ESCC顺铂耐药。此外，沉默L1CAM可以消除由KLF12耗竭产生的ESCC顺铂耐药。而过表达L1CAM也能抑制由KLF12过表达产生的ESCC顺铂敏感 (Fig. 3A)。此外，Transwell实验显示敲低KLF12显著增强ESCC细胞迁移能力，并可通过下调L1CAM消除。
临床队列研究也表明，ESCC中KLF12与L1CAM存在负调控关系，并与顺铂耐药显著关联（Fig. 3E-3G）。
为了进一步拓展研究，作者在KYSE30和HEK293细胞中表达Flag-KLF12，并利用Flag IP-MS鉴定与KLF12互作的蛋白。结合韦恩图筛选 (Fig. 4B)，Co-IP (Fig. 4C和4D)、共定位分析 (Fig. 4E)和GST pulldown验证(Fig. 4F)，作者发现TRIM27与KLF12互作 。
为了明确TRIM27与KLF12的互作域，作者构建了不同的TRIM27和KLF12截断，借助Co-IP和WB验证，作者发现KLF12 N端区域缺失（KLF12 Δ1-100截断）或TRIM27 RING/B box域缺失都会干扰KLF12和TRIM27之间的相互作用(Fig. 4G和4H)。
5、TRIM27解除KLF12对L1CAM的转录抑制
为了弄清TRIM27对KLF12的影响，作者在KYSE30和KYSE70细胞中敲低TRIM27。qRT-PCR表明敲低TRIM27抑制L1CAM表达，但不影响KLF12。随后，作者整合TRIM27敲低和对照细胞、KLF12敲低和对照细胞的RNA-seq，利用韦恩图筛选（Fig. 5C）和qRT-PCR验证（Fig. 5D），揭示TRIM27和KLF12共调控L1CAM表达。此外，Flag-KLF12 ChIP-seq证实过表达TRIM27降低KLF12在L1CAM启动子区的结合丰度（Fig. 5F）。WB也显示敲低TRIM27会抑制L1CAM表达，但对KLF12蛋白稳态无显著影响(Fig. 5G)。ChIP-qPCR(Fig. 5H)和荧光素酶实验(Fig.5I)表明TRIM27解除KLF12对L1CAM的转录抑制。
6、TRIM27介导KLF12 K326位点上泛素化
考虑到TRIM27是E3泛素蛋白连接酶，作者探索了TRIM27是否介导KLF12泛素化。利用label-free MS (Fig. 6A和6B) 、位点突变 (Fig. 6C)，作者发现TRIM27介导KLF12的泛素化主要发生在 K326。
此外，作者还发现TRIM27介导的是K33-连接多泛素化(Fig. 6F和6G)。并且，KLF12的泛素化可能影响其对L1CAM的转录抑制(Fig. 6J)。
最后，作者探究了TRIM27在顺铂耐药和肿瘤转移中的潜在作用。体外/内实验表明TRIM27耗竭增强ESCC顺铂敏感并抑制肿瘤转移(Fig. 7A-7E)。临床队列研究证实TRIM27表达与ESCC患者的顺铂耐药显著关联。
Hao Zhang, Yujia Zheng, Zhen Wang, et al. KLF12 Interacts with TRIM27 to affect Cisplatin Resistance and Cancer Metastasis in Esophageal Squamous Cell Carcinoma by regulating L1CAM Expression[J]. Drug Resistance Updates, 2024
